Evaluation of two human dental pulp stem cell cryopreservation methods / Evaluación de dos métodos de criopreservación de células troncales de pulpa dental humana

La pulpa dental es una fuente promisoria de células madre mesenquimales para ser utilizadas en terapia celular y medicina regenerativa. El desarrollo de métodos que permitan almacenar las células madre con mínimo compromiso de la viabilidad celular, capacidad de diferenciación y función es necesario para aplicaciones clínicas e investigación. El objetivo de este estudio fue evaluar si las células troncales depulpa dental humana (hDPSCs) aisladas y criopreservadas durante 1, 7 y 30 días conservan la viabilidad y expresiónde marcadores específicos de células troncales pos crio-preservación. Para esto, las hDPSCs se aislaron de 23pacientes sanos entre 18 y 31 años. La pulpa dental se disoció enzimáticamente, y las células CD105+ se separaron mediante el sistema Miltenyi™. Posteriormente, las hDPSCs se criopreservaron utilizando el método de Kamath y de Papaccio, se evaluó la viabilidad pos crio-preservación porcitometría de flujo (7AAD) y la expresión de marcadores CD105+/ CD73+, CD34-/CD45-. El método de Papaccio, mostró mayor viabilidad celular a los 30 días (59,5 por ciento)comparado con el método de Kamath, a 1 día (65,5%) y 7 días (56%) respectivamente. Se observó mayor expresión de los marcadores CD105+/CD34- a 1 y 7 días pos-criopreservación con el método Kamath y CD105+/CD45- a los 3 tiempos decriopreservación. CD73+ presentó mayor expresión en las hDPSCs a las 24 horas y 7 días con el método de Kamath, y al mes con el método Papaccio. Estos resultados sugieren que las hDPSCs expresan marcadores de células troncales mesenquimales postcriopreservación. Sin embargo el tiempo de criopreservación podría modificar la expresión de los marcadores probablemente por alterarla configuración espacial de las proteínas de membrana celular; o por comprometer a las células a cierto grado de diferenciación.

Dental pulp is a promising source of mesenchymal stem cells for use in cell therapy and regenerative medicine. Methods for storing stem cells with minimum compromise of cell viability, differentiation capacity and function should be developed for clinical and research applications. The aim of this study was toevaluate whether human dental pulp stem cells (hDPSCs)isolated and cryopreserved for 1, 7 and 30 days maintain viability and expression of specific stem cell markers. Human dental pulp stem cells were isolated from 23 healthy patients aged 18 to 31 years. Dental pulp was enzymatically dissociated, and CD105+ cells were separated using the Miltenyi™ system.The hDPSCs were cryopreserved using the Kamath andPapaccio methods. Post-cryopreservation viability wasmeasured by flow cytometry (7AAD) and by the expression of the phenotype markers CD105+/ CD73+, CD34-/CD45-. The Papaccio method showed greater cell viability for cells that had been frozen for 30 days (59.5%) than the Kamath method (56.2%), while the Kamath method provided better results for 1 day (65.5%) and 7 days (56%). Post-cryopreservation expression of the markers CD105+/CD34- was greater after 1 and 7 days with the Kamath method and CD105+/CD45- were expressed after all 3 cryopreservation times. There was greaterexpression of CD73+ in the hDPSCs after 1 and 7 days with the Kamath method, and after 30 days with the Papaccio method. These results suggest that hDPSCs express mesenchymal stem cell markers after cryopreservation. However, cryopreservationtime may affect marker expression, probably by altering the spatialconfiguration of cell membrane proteins or by compromising cells at a certain level of differentiation.

Purificación y caracterización de lipopolisacáridos de Eikenella corrodens 23834 y Porphyromonas gingivalis W83 / Purification and characterization of lipopolysaccharide from Eikenella corrodens 23834 and Porphyromonas gingivalis W83

La purificación de lipopolisacáridos (LPS) o endotoxinas y su caracterización es un aspecto esencial para estudios que buscan aclarar el papel de estas biomoléculas de bacterias Gram negativas presentes en la cavidad oral y su relación con enfermedades locales periodontales y sistémicas. Este estudio implementa una metodología para la extracción, purificación y caracterización de LPS a partir de bacteria completa de Eikenella corrodens 23834 y Porphyromonas gingivalis W83, utilizando técnicas previamente descritas. La extracción cruda de LPS se realizó con fenol-agua caliente; la purificación se realizó con tratamiento enzimático con nucleasas y proteasa, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (Sephacryl S-200 HR) con deoxicolato de sodio como fase móvil. La caracterización de los extractos purificados se realizó por barrido espectrofotométrico, pruebas bioquímicas de electroforesis SDS-PAGE, ensayo Purpald y la prueba cromogénica de LAL. Como control para la identificación y caracterización de los extractos purificados se utilizaron LPS comerciales de Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Rodobacter sphaeroides y Porphyromonas gingivalis. La metodología implementada permitió la obtención de LPS de elevada pureza con la identificación de KDO o heptosas, un quimiotipo de LPS-S (liso) para E. corrodens y LPS-SR (semi-rugoso) para P. gingivalis W83. Ambos LPS purificados mostraron capacidad endotóxica a bajas concentraciones. La metodología implementada en este estudio para la purificación y caracterización de LPS a partir de bacteria completa fue eficiente al compararla con los LPS comerciales.

Purification of lipopolysaccharide (LPS) or endotoxins and its characterization is an important aspect for studies aimed at clarify the role of these biomolecules from Gram negative bacteria present in the oral cavity and its relationship with periodontal and systemic diseases. This study describes an extraction, purification and characterization method of LPS from Eikenella corrodens 23834 and Porphyromonas gingivalis W83. LPS extraction was performed by using hot phenol-water; the purification was done with nuclease and protease enzymatic treatment, followed by size-exclusion chromatography (Sephacryl S-200 HR) with sodium deoxycholate as mobile phase. The characterization of the purified extracts was performed by spectrophotometric scanning, SDS-PAGE biochemical tests, Purpald assay and chromogenic LAL test. As control, commercial LPS from Escherichia coli, Salmonella typhimurium, P. gingivalis, and Rodobacter sphaeroides were used. The methodology mentioned above had allowed obtaining high purity LPS by identifying KDO or heptoses, a chemotype S-LPS (smooth) to E. corrodens; SR-LPS (semi-rough) for P. gingivalis W83. Both purified LPS showed endotoxic capacity at low concentrations. The methodology used in this study for purification and characterization of LPS from the whole bacteria was efficient when it was compared with commercial LPS.